Микробы

В настоящее время одной из наиболее острых проблем экологической биотехнологии является деструкция органических ксенобиотических соединений фосфора – фосфонатов (Рn) и неорганических фосфитов (Pt). Фосфонаты являются классом фосфорорганических соединений, характеризующихся наличием химически стабильной углерод-фосфорной связи. Эта связь устойчива к химическому гидролизу и тепловому разрушению, а также к фотолизу. Она встречается в широком ряду фосфорорганических соединений – природных и антропогенных. Последние являются основным источником загрязнения окружающей среды.

Первые синтетические фосфонаты были получены и описаны в 1944 г. Это аминоэтилфосфоновая кислота, а затем аминозамещенные алкилфосфононые кислоты. На сегодня фосфонаты входят в состав многих ксенобиотиков и широко используются в разных отраслях хозяйственной деятельности человека.

Среди этих соединений широкое распространение получил гербицид глифосат. Он является ингибитором 3-энолпирувилшикимат-5-фосфатсинтазы (ЕС 2.5.1.19) – фермента, участвующего в синтезе ароматических аминокислот, а его этил - и фенил - фосфонатные производные используются как инсектициды. Фирол 76 – олигомер винилфосфонат-метилфосфоната используется в качестве пеногасителя. Полифосфоновые кислоты используются как ингибиторы коррозии. Бифосфонат, алафосфалин и фосфономицин являются антибиотиками. Циклические эфиры ароматических бифосфонатов используются в качестве полимерных добавок. Метиленфосфоновые и гидроксиэтилидендифосфоновая кислоты широко используются как хелатные добавки к детергентам. К производным фосфонатов антропогенного происхождения относятся также нервно-паралитические отравляющие веществ (VХ, зарин и зоман).

Фосфонаты и их производные встречаются также в составе живых организмов. Одним из природных соединений, содержащих С-Р связь, является 2-аминоэтилфосфоновая кислота (2-AEР). Это соединение обнаружено у жгутиковых, обитающих в рубце овец. В дальнейших исследованиях было установлено, что 2-АЕР входит в состав фосфонолипидов, названных так по аналогии с липидами. Фосфонолипиды были найдены у простейших, жгутиковых, кишечнополостных. моллюсков, низших грибов и даже у человека. Помимо липидов, 2-AEP обнаружена в составе белков и полисахаридов. Другими представителями фосфонатов биогенного происхождения являются антибиотики, синтезируемые Streptomyces. Среди них – фосфономицин (1,2-cis-эпоксипролилфосфоновая кислота) – ингибитор биоситеза UDP N-ацетилмурамовой кислоты, компонента клеточной стенки микроорганизмов и биалафос (L-аланин-L-аланин-фосфонотрицин) – ингибитор глутаминсинтазы растений и Е. со1i. К биогенным фосфонатам относятся также фосфонопируват и фосфоноацетат.

Предполагается, что фосфонаты и фосфиты появились на ранней стадии развития Земли и могли быть предбиологическими переносчиками фосфора. Обнаружение метил-, этил - и других алкилфосфонатов с преобладанием метилфосфоната в образце метеорита Мечисон позволило его исследователям предположить, что эти соединения могли присутствовать в высоких концентрациях на Земле и на первоначальном этапе зарождения жизни. Фосфитные радикалы могли служить исходным материалом для образования винилфосфоновой кислоты, которая, в свою очередь, могла быть исходным соединением для синтеза фосфоноацетальдегида, фосфоноуксусной кислоты, этил-, 1-гидроксиэтил - и 2-гидроскифосфоновых кислот. Фосфоноацетальдегид при этом мог получаться в больших количествах.

В отличие от фосфонатов, применяемых в основном в сельском хозяйстве, использование фосфитов ассоциируется с высокотехнологичной индустрией. Поскольку утилизация фосфонатов и фосфитов может происходить одновременно с фосфонатами, или, по крайней мере, одними и теми же штаммами, проблема биодеградации последних может быть решена одновременно с биодеградацисй фосфонатов. Например, большие количества гипофосфита (H3PO2) используются в процессе металлизации при изготовлении компакт-дисков. Промышленные стоки таких производств содержат большое количество фосфора, а также органических кислот, используемых для регулирования величины рН и стабилизации ионов металлов. В данный момент отсутствует эффективная технология утилизации фосфита в сточных водах таких производств.

Фосфонаты – относительно редкий компонент биоты, поэтому естественная биодеградация их в природе происходит медленно. Превращения фосфонатов в окружающей среде мало изучены. Однако все больше и больше данных свидетельствует о способности бактерий использовать фосфонаты в качестве источника фосфора. В отличие от более лабильных O-Р, S-Р и N-Р связей, связь С—Р является крайне стабильной к химическому гидролизу, термическому расщеплению и фотолизу. Но поскольку фосфонаты все же являются компонентами живых организмов, то в принципе должны существовать метаболические пути их деструкции. Однако расщеплять С—Р связь способны в основном прокариотические микроорганизмы и некоторые низшие эукариоты. Поэтому поиск таких видов является основой для разработки технологии биодеградации ФОС. Принципом технологии является способность селективных микроорганизмов использовать фосфонаты в качестве единственного источника фосфора. Фосфонат при этом превращается в неорганический фосфат (Рi).

Следует подчеркнуть, что как фундаментальные, так и прикладные аспекты проблемы биодеградации соединений с прямой С—Р связью исследованы недостаточно. Поэтому первостепенной и наиболее актуальной задачей, требующей своего решения, является идентификация, выделение и изучение фермента С—Р лиазы, ответственной за гидролиз прямой С—Р связи.

Способность микроорганизмов использовать для роста фосфонаты дает преимущества для обладателей такого свойства. Они растут там, где отсутствует минеральный фосфат. Разнообразие фосфонатных субстратов требует разнообразия ферментативных систем для их деградации. Способность микроорганизмов использовать фосфорорганические соединения в качестве единственного источника фосфора известна сравнительно давно. Впервые доказательство биологического расщепления С—Р связи было получено на примере Е. cоli. Эта бактерия может использовать метилфосфоновую или этилфосфоновую кислоты в качестве единственного источника фосфора. Возможно, что после истощения неорганического фосфата из окружающей среды последний оказывался доступным только в виде фосфитов и фосфонатов. Поэтому микроорганизмы выработали ферментные системы для их катаболизма. Это косвенно подтверждается работами по молекулярно-генетическому анализу окисления фосфита и гипофосфита клетками Pseudomonas stuzeri WМ88. Результаты этих работ указывают на наличие взаимосвязи между метаболизмом фосфонатов, фосфита и гипофосфита. Часть генов оперона, кодирующего разложение последних, оказалась гомологичной генам, отвечающим за разрушение связи С-Р в алкилфосфонатах. Также было установлено, что мутации, вызывающие нарушение потребления фосфонатов, приводят к нарушению потребления и фосфитов.

Помимо Е. соli и Ps. Stutzeri, к утилизация фосфонатов и фосфитов способна и Klebsiella aerogenes [36]. Анализ опубликованных к настоящему времени работ свидетельствует о наличии в природе широкого круга микроорганизмов-деструкторов фосфонатов, среди которых имеются как грам-положительные, так и грам-отрицательные формы, а также некоторые виды дрожжей и низших грибов. Однако предполагается, что разлагать фосфонаты способны, скорее всего, только отдельные штаммы разных видов, а не определенные группы микроорганизмов. Попытка очертить круг видов, способных к утилизации фосфонатов, а также проанализировать спектр потроебляемых субстратов, была предпринята в двух работах. Так, в первой работе из пяти почвенных изолятов были выделены бактерии, способные разлагать широкую группу структурно различных фосфонатов. Прежде всего, это различные штаммы микроорганизмов, принадлежащие к роду Pseudomonas, и вида Bacillus megaterium, способные разлагать 14 из 15 исследованных субстратов. Данные результаты сопоставимы со спектром разлагаемых фосфонатов, выявленным ранее у Agrobacterium radiobacter. В этой работе впервые было показано, что грам-положительиые бактерии могут осуществлять прямое разложение связи С—Р. Однако ни один из изолятов не был способен разлагать изопропилфосфонат или фосфинатный гербицид фосфинотрицин. Во второй работе способность расти на различных природных и ксенобиотических фосфонатах (как единственных источниках фосфора) была проанализирована у микроорганизмов из семи экосистем и у 19 лабораторных культур микроорганизмов. Доказано наличие деструкторов фосфонатов среди различных видов бактерий и других систематических групп, выделенных как из загрязненных, так и из не загрязненных фосфонатами природных источников. Это свидетельствует о более широком, чем предполагалось ранее, распространении среди микроорганизмов свойства разлагать фосфонаты. Было подтверждено отсутствие способности к деградации фосфонатов эукариотическими организмами, за исключением дрожжей и низших грибов. Для Rhodobacter capsulatus обнаружена способность разлагать полифосфоновые кислоты. Исследования по деградации фосфонатов микроорганизмами, естественно, не ограничиваются только рассмотренными работами.

Совсем недавно были идентифицированы бактериальные штаммы, способные полностью разлагать как природные, так и ксенобиотические фосфонаты в качестве источников не только фосфора, но и азота и углерода. Эти изоляты содержали новые индуцибельные ферменты с высокой специфичностью к отдельным субстратам и стали основанием для отхода от ранее принятой концепции, согласно которой фосфонаты используются организмами только как источники фосфора. Имеются два сообщения об использовании фосфонатов как единственных источников азота дрожжами: природной 2-амино-3-фосфонопронионовой кислоты (фосфоноаланииа) клетками Candida maltose и синтетического 4-аминобутилфосфоната клетками Kluyveromyces fragilis. В последнем случае использование фосфоната не зависело от фосфорного статуса клеток, подобно тому, как это происходит при деградации 2-АЕР клетками Ps. Putida.

Изучение биосинтеза фосфонатов с целью выяснения механизма образования связи С—Р было проведено на примере 2-АЕР. Показано, что первым шагом на пути образования этой связи является внутримолекулярная перестройка фосфоенолпирувата в фосфонопируват, катализируемая фосфоенолпируват-фосфомутазой. Фосфонопируват под действием фермента фосфонопируват-декарбоксилазы затем превращается в фосфоноацетальдегид. Фосфоноацетальдегид может превратиться или в 2-гидроксипропилфосфоновую кислоту в процессе биосинтеза фосфономицина, или в гидроксиметилфосфоновую кислоту в процессе биосинтеза биалофоса. Таким образом, фосфонопируват-декарбоксилаза является одним из ключевых ферментов биосинтеза различных фосфонатов.

Помимо вышеупомянутых ферментов открыты еще два, отвечающие за образование связей С—Р в биалофосе — карбоксифосфоенолпируватмутаза и «Р-метилирующий фермент». Открытие ферментов биосинтеза связи фосфонатов позволило предположить, что при соответствующих условиях в клетке те же ферменты могли бы осуществлять и обратные реакции, т.е. участвовать в расщеплении С—Р связи. Действительно, как было показано позднее, фосфоноенолпируват-фосфомутаза принимает участие в биодеградации фосфоноаланина. Предполагается, что вследствие наличия в фосфонатах химически стабильной и устойчивой к действию фосфатаз связи С—Р способность синтезировать фосфонаты могла дать микроорганизмам некоторые биологические преимущества при выживании в потенциально бедной по фосфору морской среде и в борьбе за экологические ниши.

Что касается катаболизма фосфонатов, то в настоящее время известно несколько ферментов, осуществляющих этот процесс: фосфонатаза (фосфоноацетальдегидгидролаза (КФ 3.11.1.1), специфически разлагающая 2-АЕР; фосфоноацетатгидролаза, расщепляющая фосфоноацетат; фосфонопируватгидролаза и С—Р-лиаза. Последняя может разлагать широкий спектр фосфонатов в интактных бактериальных клетках.

Первый фермент, способный разрушать углерод-фосфорную связь, — 2-фосфоноацетальдегидгидролаза (фосфонатаза) — был идентифицирован и выделен из грамположительной бактерии Bacillus cereus. Эта бактерия способна разлагать 2-АЕР, используя его в качестве единственного источника фосфора. 2-АЕР превращается сначала в 2-фосфоноацетальдегид с помощью фермента 2-АЕР-пируватаминотрансферазы (КФ 2.6.1.37), который далее распадается на ацетальдегид и ортофосфат в реакции, катализируемой фосфонатазой. В последней реакции происходит разрушение С—Р связи с образованием ковалентно связанного иминового нитермедиата с карбонильной группой и боковой цепью остатка лизина в ферменте. Фосфонатаза была выделена и очищена. Она проявляла оптимальную активность при рН8 и требовала для активности ионы Мg(2+), ингибировалась реагентами, разрушающими дисульфидную связь, и состояла из двух субъединиц с молекулярной массой 33-37 кДа каждая. По многим свойствам фосфонатаза напоминает щелочную фосфатазу Е. соli, но отличается тем, что не разлагает многие фосфомоноэфиры. Круг фосфонатазных субстратов намного уже и этот фермент не является, в отличие от фосфатазы, металлоферментом. Предполагается, что путь деградации 2-АЕР существует во всех организмах, способных использовать этот субстрат в качестве источника фосфора. И действительно, он был обнаружен, например, в Ps. Aeroginosa, Salmonella typhimurium, В. Cereus и у Pseudomonas sp.

Помимо деградации 2-АЕР, фосфонатаза может участвовать и в разложении глифосата, как это было показано для Artrobacter atrocyanus. Гены фосфонатаз из Salmonella typhimurium и Bacillus cereus в настоящее время клонированы и секвенированы. Их анализ показал, что фосфонатазы принадлежат к новому семейству гидролаз, имеющие высококонсервативный аспартатный остаток в активном центре, на который переносится фосфорильная группа с лизинового остатка фермента. Исследование кристаллической структуры фосфонатазы из Bacillus сereus показало, что фермент является гомодимером. Анализ встречаемости полярных аминокислотных остатков в активных центрах дегалогеназ, фосфонатаз, фосфатаз и фосфомутаз, принадлежащих к NАD-зависимому суперсемейству, указывает на то, что активный центр этих ферментов может иметь общее происхождение. Молекулярно-генетическая характеристика гена фосфонатазы из Salmonella typhimurium и Enterobacter aerogenas показала, что он является членом Pho-регулона и, следовательно, его экспрессия индуцируется при фосфорном голодании и регулируется ортофосфатом среды.

Фосфоноацетатгидролаза была найдена в Ps. fluorescens 23F. Этот фермент индуцируется фосфоноацетатом и не требует для своей индукции состояния фосфорного голодания, а продукты его разложения — фосфат и ацетат — легко используются клеткой. Ген, кодирующий фосфоноацетатгидролазу, был клонирован, а фермент очищен и охарактеризован. Фермент состоит из двух идентичных субъединиц с молекулярной массой 40 кДа. Анализ области структурного гена фосфоноацетатгидролазы (phnА) обнаружил пять открытых рамок считывания. Как было показано, 2-фосфонопропионат также является индуктором, но плохим субстратом для этого фермента. Для разложения обоих субстратов, как полагают, необходима экспрессия трех генов — рhnА, рhnВ, рhnR.

У Burkhoderia cepacia Pal6 L-фосфоноаланин используется в качестве источника азота, углерода или фосфора с помощью фермента фосфонопируватгидролазы, ранее описанного как фосфоенолпируват-фосфомутаза. Фосфонопируват является продуктом трансамирования L-фосфоноаланина и расщепляется на пируват и Рi. Кинетические свойства этого фермента были частично охарактеризованы. Молекулярную массу нативного белка определили равной 232 кДа. Эти свойства фермента оказались близки к таковым для фосфоенолпируват-фосфомутазы, выделенной из Ps. gladioli В-1.

И, наконец, фермент С—Р-лиаза. Она, как полагают, отвечает за расщепление неактивированных связей С—Р алкилфосфонатов с образованием ортофосфата и соответствующих алканов. Ортофосфат потребляется всеми видами бактерий и растений. С—Р-лиаза проявляет свою активность только в нативных клетках и никогда достоверно не была обнаружена в бесклеточных экстрактах  (определение такой активности in vitro, как оказалось впоследствии, было некорректным). Это существенно ограничивает возможность изучения механизма действия данного фермента.

Было предложено, однако, несколько гипотетических механизмов расщепления связи С—Р по С—Р-лиазному пути. Первая рабочая гипотеза предполагала окисление клетками Е. cоli, растущими в аэробных условиях, алкилфосфоновых кислот по первому углеродному атому, непосредственно связанному с фосфором за счет внедрения атомарного или молекулярного кислорода в это положение. Образующиеся при этом альфа-гидроперокси-, альфа-гидрокси-, альфа-кето - или фосфомоноэфиры могли бы легко потребляться клетками. Однако исследования деградации алкилфосфонатов клетками этой бактерии с помощью изотопно меченного материала не выявили интермедиатов, соответствующих предполагаемому механизму.

Действительно, главным феноменом деградации метилфосфоновой кислоты клетками E. coli является преимущественное образование в качестве конечного продукта реакции метана в соотношении 1:1 к образующемуся из алкилфосфосфонатов внутриклеточному фосфору. Этан, пропан, бутан, пентан и гексан образуются этими клетками при использовании соответствующих производных фосфоновой кислоты. Пристальное исследование продуктов деградации указанных алкилфосфонатов выявило также присутствие соответственно этена, пропена, бутена и т.д. Результаты анализа продуктов деградации алкилфосфонатов не укладываются, таким образом, в первоначально предложенный механизм и предполагают возможность наличия другого механизма — редокс-зависимого свободно-радикального дефосфорилирования, вероятно, включающего также участие в реакциях переходных металлов. Согласно этому механизму, процесс инициируется образованием фосфонильного радикала, последующая фрагментация которого приводит к образованию метафосфата и алкильного радикала, который, в свою очередь, акцептируя атом водорода, превращается в алкан. Образование алкильного радикала является специфической особенностью деградации алкилфосфонатов. Обнаружение среди продуктов деградации не только алканов, но и алкенов свидетельствует в пользу свободно-радикального механизма. Каков конечный фосфорный продукт, до сих пор остается неясным. Предполагается, что образующаяся мономерная метафосфорная кислота, быстро реагируя с водой, образует ортофосфат.

Однако есть и альтернативное предположение, согласно которому в катализе разложения связи С—Р принимают участие АТФ или другие нуклеотиды. Учитывая, что среди продуктов деградации алкилфосфонатов имеется альфа-1-этилфосфонорибоза, не исключено, что именно нуклеотиды являются акцепторами фосфорильной группы алкилфосфонатов. Свободно-радикальный механизм деградации алкилфосфонатов косвенно подтверждается в ряде других экспериментов. Химическое моделирование такого процесса было осуществлено с помощью реакции алкилфосфоновых кислот с тетраацетатом свинца и их электрохимического окисления на платиновом аноде. Образование алканов и алкенов в результате бактериальной деградации алкилфосфонатов и их химической деградации тетраацетатом свинца отражают определенную аналогию между биодеградацией и ее химической моделью. Аналогия свидетельствует в пользу свободно-радикального механизма биодеградации фосфонатов по С—Р-лиазному пути.

Учитывая все вышесказанное, можно заключить, что только микроорганизмы, разлагающие алкилфосфонаты с образованием алканов, обладают С—Р-лиазой, хотя ее субстратная специфичность может и не ограничиваться алкилфосфонатами. Некоторые из указанных микроорганизмов способны разлагать и другие фосфонаты, в том числе глифосат и 2-АЕР.

Большинство видов бактерий, для которых точно установлено разложение фосфонатов по С—Р-лиазному механизму, относятся к грам-отрицательным, однако известны два представителя грам-положительпых бактерий, обладающих C—P - лиазой. Это Arthrobacter sp. GLP-1 и Bacillus megaterium. Среди почти сорока идентифицированных почвенных изолятов и коллекционных штаммов бактерий, проверенных на С—Р-лиазную активность, только вышеупомянутые грам-положитсльные бактерии обладали ею. У других исследованных грам-положетельных бактерий (Corynebacterium glutamicum MB-1789, Arthrobacter globiformis ATCC 8010, Bacillus subtilis, Bacillus cereus ATCC 13061, Bacillus brevis ATCC14579, Arthrobacter globiformis DSM 20124, Arthrobacter paraffineus ATCC21298, Arthrobacter histidinolovorum DSM 20115, Arthrobacter paraffineus DSM 312, Arthrobacter oxydans DSM 420, Arthrobacter variadilis DSM 20132, Arthrobacter sp. DSM 20389, Arthrobacter atrocyanis DSM 20217, Staphylococcus aureus) С—Р-лиазную активность обнаружить не удалось. Еще одним представителем бактерий, разлагающим фосфонаты по С—Р-лиазному механизму, является Rhodobacter capsulatus, фототрофная грам-отрицательная бактерия, способная разрушать связь С—Р в анаэробных услониях на свету. Поиск С—Р-лиазной активности среди представителей грибов (Cladosporium herbarum, Fusarium calmorum и Trichoderma virida) не дал положительных результатов.

Таким образом, способность разлагать фосфонаты по С—Р-лиазному механизму встречается среди грам-отрицатсльных бактерий гораздо чаще, чем среди грам-положительных бактерий. C—P-лиазой обладают отдельные представители семейств Arthrobacteriaceae, Bacillaceae, Rhodobacteriaceae, Pseudomonodaceae, Enterobacteriaceae, (Escherihia, Klesiella, Kluyvera) и Rhizobiaceae (Rhizobium, Agrobacterium).

В последние годы достигнуты значительные успехи в генетической характеристике системы, кодирующей разложение алкилфосфонатов микроорганизмами. Так, у E. coli проведено картирование и молекулярное клонирование генов кластера phn, ответственных за С—Р-лиазную активность, а также мутационный анализ этих генов. Показано, что за использование фосфонатов клетками E. coli отвечает кластер из 14 генов — одна из наиболее крупных транскрипционных единиц E. сoli, экспрессия которой контролируется Pho-регулоном, Его активность, в свою очередь, регулируется экзогенным ортофосфатом. Первоначально локус phn в штамме E. coli К-12 путем конструирования и анализа гибридных генов Mud1 (bla lacZ) был идентифицирован как ген psiD, экспрессия которого индуцируется фосфорным голоданием. Затем он был переименован в phn, когда было обнаружено, что встраивание бактериофага «мю» в локус psiD приводит к тому, что штамм перестает расти на среде, содержащей метилфосфоновую кислоту в качестве единственного источника фосфора. Тот факт, что мутанты E. сoli по генам кластера phn не могут использовать алкилфосфонаты в качестве единственного источника фосфора, позволиляет предположить, что гены этого кластера кодируют С—Р-лиазу.

На начальном этапе молекулярно-генетического исследования этого локуса был выделен фрагмент размером 15611 пар оснований, в котором было идентифицировано 17 открытых рамок считывания в одном направлении, обозначенных в алфавитном порядке как phnA-phnQ, и пять открытых рамок считывания в другом направлении. Дальнейший анализ показал, что гены phnA, phnB и phnQ не кодируют деградацию фосфонатов. Окончательно идентифицированный оперон, ответственный за деградацию фосфонагов у E. coli, размером 10,9 тысяч пар оснований состоит из 14 генов phnCDEFGHIJKLMNOP, локализованных примерно на 92,8 минуте хромосомной карты. Он, по-видимому, транскрибируется под управлением единственного промотора, расположенного перед геном phnC. В результате генетического анализа было установлено  следующее:

Таким образом, молекулярно-генетические исследования позволяют предположить, что процесс деградации алкилфосфонатов происходит под действием мультиферментного комплекса, отдельные компоненты которого локализованы как в мембране, так и периплазме, что ранее абсолютно не учитывалось при поиске С—Р-лиазной активности в бесклеточных экстрактах и, возможно, было причиной, затруднившей идентификацию фермента.

Гены, гомологичные phn генам E. coli, были обнаружены также у Rhizobium meliloti. Экспрессия клонированных в плазмиды phn генов Rhizobium meliloti выявила повышенный синтез генных продуктов 16, 22, 29 кДа, соответствующих PhnG, PhnH и PhnK компонентам. Эти белки не подвергаются посттрансляциоиной модификации (удалению сигнального пептида) и синтезируются только в клетках, выращенных на метилфосфонате, аминометилфосфонате и глифосате в качестве единственных источников фосфора.

Представляет интерес тот факт, что компонент PhnJ С—Р-лиазного комплекса Rhizobium meliloti имеет на С-конце остаток гистидина в окружении, гомологичном таковому для липооксигеназы Oriza sativa, и может служить лигандом металлов. Кроме того, PhnJ имеет четыре консервативных цистеиновых остатка, которые также могут быть лигандами металлов или сайтами связывания серосодержащих комплексов металлов. Это позволяет предположить участие металлов в катализе деградации алкилфосфонатов. Примечательной особенностью Rhizobium meliloti, отличающей этот вид от E. coli, является широкий спектр разлагаемых фосфонатов, сходный по охвату с видами Agrob. radiobacter и Artrobacter sp.. В арсенале средств этих видов имеется два различных С—Р-лиазных комплекса, тогда как у Rhizobium meliloti — только один. Было также установлено, что Rhizobium meliloti содержит фермент деградации 2-АЕР, генетически и биохимически отличающийся от С—Р-лиазы, что и определяет, по-видимому, более широкую субстратную снецифичность этого организма. В то же время фосфоноацетатгидролаза не была в нем обнаружена. Наличие генов, кодирующих С—Р-лиазный комплекс, или белков, имеющих сходство с его компонентами, показано в настоящее время не только для E. coli и Rhizobium meliloti, но также для Rhizobium leguminosarum, Mesorhizobium loti, Ps. aeroginosa РА01, Ps. stutzeri WM88, Klebsiella aerogenes и Enterobacter aerogenes.

Как было сказано выше, у Е. coli гены оперона phn, кодирующие деградацию фосфонатов по С—Р-лиазному механизму, индуцируются при фосфорном голодании. Промотор этого оперона содержит последовательность из 18 пар оснований CTGTtAgtcActTtTaAT, сходную со смысловой последовательностью, обнаруженной в промоторах pho-генов (так называемый РНО-бокс). Таким образом, гены ассимиляции фосфонатов являются членами Pho-регулона. Их экспрессия репрессируется экзогенным Pi и требует экспрессии генов phoB и phoR, кодирующих соответственно регулятор и сенсор двухкомпонентной системы передачи Pi-сигнала. Pho-регулон является универсальной системой, обеспечивающей ответ клетки на дефицит экзогенного Pi. Эта система обнаружена во многих таксономических группах микроорганизмов. В Pho-регулон Е. coli входят несколько генов, индуцируемых состоянием фосфорного голодания. Продукты этих генов участвуют в первичной ассимиляции фосфора из окружающей среды. Среди них:

Принадлежность С—Р-лиазы к фосфатному регулону доказана не только наличием РНО-бокса в операторе локуса phn. Показано, что клетки не способны продуцировать С—Р-лиазу и разлагать метилфосфонат с образованием метана в штаммах с не индуцибельным Pho-регулоном вследствие мутации в транскипционном регуляторе PhoB. Мутации по генам, контролирующим синтез компонентов репрессора Pho-регулона, наоборот, приводят к тому, что С—Р-лиаза продуцируется даже в присутствии Pi . То же самое наблюдается рекомбинантных штаммах Е. coli, в которых оперон phn клонирован под контролем промотора, не регулируемого Pi, например, lac-промотора. Следует также отметить, что в мутантах по структурному гену щелочной фосфатазы уровень синтеза С—Р-лиазы сопоставим с таковым для дикого штамма, и продукция этого фермента не сопровождается появлением фосфатазной активности, свидетельствуя, что щелочная фосфатаза не ответственна за С—Р-лиазную активность, а С—Р-лиаза не обладает фосфатазной активностью.

Транскрипционная регуляция генов pho осуществляется с участием двухкoмпонентных регуляторных систем трансдукции сигнала Pi: PhoB-PhoR у грам-отрицательных бактерий и PhoP-PhoR у грам-положительных бактерий. Белки PhoB и PhoP являются транскрипционными регуляторами, которые непосредственно связываются с промоторами генов pho. Белок PhoR является трансмембранным сенсором, который воспринимает сигнал Pi из окружающей среды, аутофосфорилируется и участвует в специфическом фосфорилировании/дефосфорилировании транскрипционных регуляторов. Фосфорилированные транскрипционные регуляторы индуцируют транскрипцию pho генов. Дерепрессия генов Pho-регулона осуществляется при дефиците P i во внешней среде, при этом концентрация Pi в клетке остается достаточно высокой.

При избытке экзогенного Pi экспрессия генов Pho-регулона репрессируется за счет образования репрессорного комплекса, в состав которого входят белки PhoR, PhoU и все белки Pst-системы транспорта Pi (PstA, PstB, PstC, PstS). Индукторами Pho-регулона могут быть также компоненты других регуляторных систем (при так называемой перекрестной регуляции), например, ацетилфосфат. Системы фосфат-независимого контроля экспрессии генов Pho-регулона сопряжены с центральным метаболизмом клетки и регулируются источником углерода. Одна функционирует при росте клеток на глюкозе и требует наличия сенсорного белка CreC (PhoM), другая — при росте клеток на пирувате и сопряжена с синтезом ацетилфосфата с последующей активацией PhoB непосредственно или посредством одного из сенсорных белков.

Таким образом, экспрессия генов Pho-регулона может подвергаться контролю не только со стороны фосфата среды, но также и глобальному контролю, который связывает белки-регуляторы этой двухкомпонентной системы с другими системами передачи сигналов и с общим метаболизмом клетки. Это очень важно учитывать при поиске оптимальных условий деградации фосфонатов и биосинтеза С—Р-лиазы, являющейся членом Pho-регулона.

Важной физиологической особенностью деградации фосфонатов является необходимость адаптации клеток к этим соединениям. Действительно, уже в ранних физиологических исследованиях деградации фосфонатов было показано, что разложение этих соединений и использование их клетками в качестве единственных источников фосфора начинается после длительного латентного периода. Продолжительность латентного периода, предшествующего росту на фосфонатах, сильно варьирует в зависимости от вида микроорганизма и природы субстрата, подтверждая множественность путей деградации фосфонатов. Некоторые бактерии, например, Pseudomonas sp. 4ASW, потребляли фосфонаты с такой же скоростью, как Pi, однако, латентная фаза, предшествующая росту, была достаточно длительной. Более того, продолжительность этой латентной фазы показывала определенную корреляцию с последующей максимальной скоростью роста. Фосфонаты, которые потребляются клетками после непродолжительной лаг-фазы (глифосат, фенилфосфонат, аминометилфосфонат, фосфоноацетат), поддерживают сравнительно высокую скорость роста. Рост В. megaterium на большинстве фосфонатов характеризовался более продолжительным лаг-периодом и меньшей скоростью роста по сравнению с ростом на фосфатах.

Регуляция прямого разложения связи С—Р была изучена на примере Pseudomonas sp. 4ASW. В питательную среду, лимитированную по фосфору, вносили 0,15-0,3 мМ Pi+ фенилфосфонат или 2-АЕР и измеряли скорости роста и потребления субстратов. Было показано, что при одновременном присутствии фенилфосфоната и Pi предпочтительно потребляется Pi, при этом потребляется и фенилфосфонат. Рост быстрее начинается на Pi и происходит с такой же скоростью при совместном присутствии PI и фенилфосфоната. В присутствии одного фенилфосфоната скорость роста такая же, но рост начинается только после более продолжительного лаг-периода. Выход биомассы в обоих случаях одинаковый. Для Pseudomonas sp. 4ASW строгого контроля со стороны Pi как транспорта фосфоната, так и его разложения не обнаружено, в отличие от Kluyv. ascorbata. Регуляция в Pseudomonas sp. 4ASW более близка к таковой для вида Agrob. radiobacter. Клетки Е. coli К начинали разлагать метилфосфоновую кислоту только через 48-70 часов в отсутствие других источников фосфора, и это сопровождалось достаточно медленным ростом.

Возможно предложить несколько объяснений латентного периода в потреблении фосфонатов и роста клеток на них. Прежде всего, для синтеза индуцибельных ферментов необходимо определенное время. Интервал времени от момента начала синтеза этих ферментов до момента, когда их действие можно измерить имеющимися аналитическими методами, является латентным периодом. Возможно также, что в сложном процессе деградации фосфонатов существуют «узкие места» (например, их транспорт в клетку), лимитирующие общую скорость всего процесса их деградации. Оказалось, что процесс деградации включает специфические индуцибельные транспортные системы (например, для 2-АЕР), обычные системы транспорта связанных компонентов, и системы, подверженные ингибированию Рi.

Для реализации разных транспортных систем требуется различное время. Известно, например, что фосфонопептиды транспортируются в клетки легче, чем свободные фосфонаты. Возможно, поэтому выявлена в 9 раз более продолжительная лаг-фаза и редуцированная скорость роста Pseudomonas sp. 4ASW при использовании 1-аминоэтилфосфоната по сравнению с пептидным аналогом алафосфалином.

Другой предполагаемой причиной латентного периода при потреблении фосфонатов, особенно алкилфосфонатов, может быть образование адаптивных мутантов. Известно, что адаптивные мутанты, выживающие в новых условиях, могут образовываться в условиях дефицита тех или иных питательных веществ, особенно в присутствии альтернативных источников питания. Накопление таких мутантов также требует времени. Селекция возможных мутантов впервые была недавно проведена на примере нескольких штаммов Е. coli. Анализ динамики клеточной популяции в процессе адаптации к метилфосфонату выявил ее гетерогенность — наличие клеток, дающих мелкие и крупные колонии, причем в процессе адаптации число последних увеличивается, и это увеличение коррелирует с повышением эффективности деградации метилфосфоната. Была проведена селекция микробных клеток по размерам образуемых ими колоний, а также их физиологическая и биохимическая характеристика. Выделенные изоляты имели одинаковую скорость роста на питательной среде с неорганическим фосфатом. Но на среде с метилфосфонатом скорость роста мутантных изолятов оказалась выше на порядок скорости роста исходных штаммов. Адаптированные клетки имели повышенное содержание некоторых белков. Возможно, эти белки являются компонентами С—Р-лиазного комплекса. Субклеточные фракции адаптированных клеток не проявляли, однако, С—Р-лиазную активность.

Механизм адаптации также остался неясным. Один из возможных механизмов адаптации можно объяснить с помощью результатов генетического анализа генов С—Р-лиазного комплекса у Е. coli K12. В гене phnE обнаружена вставка из восьми нуклеотидов, приводящая к мутациям со сдвигом рамки считывания. На среде, содержащей метилфосфоновую кислоту в качестве единственного источника фосфора, штамм Е. coli K12 начинает расти после спонтанной активации оперона phn, которая сопровождается потерей этой вставки.

Исследование различных бактерий позволило выявить ряд и других физиологических особенностей разложения фосфонатов. Так, ни разу не было выявлено интенсивного потребления фосфонатов. В большинстве случаев полнота разложения составляла 20-50% от теоретически возможной, причем фосфонат всегда потреблялся из среды в соответствии с ростом культуры, хотя и не линейно. Потребление 2-АЕР было более быстрым и почти полностью завершалось в течение 7 дней. Примерно с такой же скоростью потреблялся глифосат, однако полнота потребления достигала 40-45%.

Наиболее интенсивному разложению подвергались полифосфонаты со сложной разветвленной структурой, указывая на то, что с помощью микроорганизмов возможна даже квазисложная деградация. Максимальное потребление метилфосфоновой кислоты клетками Е. coli при концентрации ее в среде 2,5 мМ не превышало в большинстве случаев 30% от теоретически возможного. Этот процент увеличивался при снижении концентрации метилфосфоната в среде, однако максимальное разложение субстрата оставалось тем же, составляя 400 нмоль на единицу ОП клеток. Это ограничение, так же как отсутствие роста на некоторых фосфонатах, не было следствием их токсичности, поскольку помещение клеток на среду с Pi приводило к нормальному росту культуры.

Важным фактором, определяющим скорость разложения фосфонатов, оказалась аэрация. С использованием штаммов Е. coli было показано, что в некоторых из них деградация фосфонатов ингибируется свободным кислородом, в то время как для других требуются микроаэрофильные условия. Свободный азот ингибирует этот процесс. Таким образом, роль аэрации еще не вполне ясна. На примере фотосинтетика Rhodobacter capsulatus показана деградация фосфонатов в анаэробных условиях, т.е. без участия молекулярного кислорода.