Микробы

Вода является естественной средой обитания многих микробов. Основная масса микробов поступает из почвы. Количество микробов в 1 мл воды зависит от наличия в ней питательных веществ. Чем вода сильнее загрязнена органическими остатками, тем больше в ней микробов. Наиболее частыми являются воды глубоких артезианских скважин, а также родниковые воды. Обычно они не содержат микробов. Особенно богаты микробами открытые водоемы и реки. Наибольшее количество микробов в них находится в поверхностных слоях (в слое 10 см от поверхности воды) прибрежных зон. С удалением от берега и увеличением глубины количество микробов уменьшается. В чистой воде находится 100— 200 микробных клеток в 1 мл, а в загрязненной — 100— 300 тыс. и больше.

Реки в районах городов часто являются естественными приемниками стоков хозяйственных и фекальных нечистот, поэтому в черте населенных пунктов резко увеличивается количество микробов. Но по мере удаления реки от города число микробов постепенно уменьшается, и через 3—4 десятка километров снова приближается к исходной величине. Это самоочищение воды зависит от ряда факторов: механическое осаждение микробных тел, уменьшение в воде питательных веществ, усвояемых микробами, действие прямых лучей солнца, пожирание бактерий простейшими и др.

Если считать, что бактериальная клетка имеет объем 1 мк3, то при содержании их в количестве 1000 клеток в 1 мл, получится около тонны живой бактериальной массы в кубическом километре воды. Такая масса бактерий осуществляет различные превращения в круговороте веществ в водоемах и является начальным звеном в пищевой цепи питания рыб.

Патогенные микробы попадают в реки и водоемы со сточными водами. Возбудители таких кишечных инфекций, как брюшной тиф, паратифы, дизентерия, холера и др., могут сохраняться в воде длительное время. В этом случае вода становится источником инфекционных заболеваний.

Особенно опасно попадание болезнетворных микробов в водопроводную сеть. Поэтому за состоянием водоемов и подаваемой из них водопроводной воды установлен сани-тарно-бактериологический контроль.

Санитарно-микробиологическнй анализ питьевой

Отбор пробы воды

Для отбора проб воды используют специально предназначенную для этих целей одноразовую посуду или емкости многократного применения, изготовленные из материалов, не влияющих на жизнедеятельность микроорганизмов. Емкости должны быть оснащены плотно закрывающимися (силиконовыми, резиновыми или из других материалов) пробками и защитным колпачком (из алюминиевой фольги, плотной бумаги). Многоразовая посуда, в том числе пробки, должны выдерживать стерилизацию сухим жаром или автокла-вированием.

Пробу отбирают в стерильные емкости с соблюдением правил стерильности. Емкость открывают непосредственно перед отбором, удаляя пробку вместе со стерильным колпачком. Во время отбора пробка и края емкости не должны чего-либо касаться. Ополаскивать посуду запрещается.

При исследовании воды из распределительных сетей отбор проб из крана производят после предварительной его стерилизации обжиганием и последующего спуска воды не менее 10 минут при полностью открытом кране. Если отбирают воду после обеззараживания химическими реагентами, то для нейтрализации остаточного количества дезинфектан-та в емкость, предназначенную для отбора проб, до стерилизации вносят натрий серноватистокислый в виде кристаллов или концентрированного раствора из расчета 10 мг на 500 мл воды.

После наполнения емкость закрывают стерильной пробкой и колпачком. Отобранную пробу маркируют и сопровождают актом отбора проб воды с указанием названием пробы, места забора, даты (год, месяц, число, час), цель исследования, куда направляется проба для исследования, подпись лица, взявшего пробу.

Безопасность питьевой воды по эпидемиологическим показателям (по СанПиНу 2.1.4.559-96)

Показатели

Единицы измерения

Нормативы

Термотолерантные колиформные бактерии

Число бактерий в 100 мл

Отсутствие

Общие колиформные бактерии

Число бактерий в 100 мл

Отсутствие

Общее микробное число

Число образующих колоний бактерий в 1 мл

Не более 50

Колифаги

Число бляшкообразую-щих единиц в 100 мл

Отсутствие

Споры сульфитреду-цирующих клост-ридий

Число спор в 20 мл

Отсутствие

Цисты лямблий

Число цист в 50 мл

Отсутствие

Хранение и транспортировка проб воды

К исследованию проб в лаборатории необходимо приступить как можно быстрее с момента отбора.

Доставка проб осуществляется в контейнерах-холодильниках при температуре 4—10°С. В холодный период года контейнеры должны быть снабжены термоизолирующими материалами, обеспечивающими предохранение проб от промерзания. При соблюдении указанных условий срок начала исследований от момента отбора проб не должен превышать 6 часов.

Если пробы нельзя охладить, их анализ следует провести в течение 2 часов после забора.

При несоблюдении времени доставки пробы и температуры хранения анализ проводить не следует.

Подготовка посуды к анализу

Лабораторная посуда должна быть тщательно вымыта, ополоснута дистиллированной водой до полного удаления моющих средств и других посторонних примесей и высушена.

Пробирки, колбы, бутылки, флаконы должны быть заткнуты силиконовыми или ватно-марлевыми пробками и упа - кованы так, чтобы исключить загрязнение после стерилизации в процессе работы и хранения. Колпачки могут быть металлические, силиконовые, из фольги или плотной бумаги.

Новые резиновые пробки кипятят в 2%-м растворе натрия двууглекислого 30 минут и 5 раз промывают водопроводной водой (кипячение и промывание повторяют дважды). Затем пробки 30 минут кипятят в дистиллированной воде, высушивают, заворачивают в бумагу или фольгу и стерилизуют в паровом стерилизаторе. Резиновые пробки, использованные ранее, обеззараживают, кипятят 30 минут в водопроводной воде с нейтральным моющим средством, промывают в водопроводной воде, высушивают, монтируют и стерилизуют.

Пипетки со вставленными тампонами из ваты должны быть уложены в металлические пеналы или завернуты в бумагу.

Чашки Петри в закрытом состоянии должны быть уложены в металлические пеналы или завернуты в бумагу.

Подготовленную посуду стерилизуют в сухожаровом шкафу при 160—170°С 1 час, считая с момента достижения указанной температуры. Простерилизованную посуду можно вынимать из сушильного шкафа только после его охлаждения ниже 60°С.

После выполнения анализа все использованные чашки и пробирки обеззараживают в автоклаве при (126 ± 2)°С 60 минут. Пипетки обеззараживают кипячением в 2%-м растворе NaHC03.

После охлаждения удаляют остатки сред, затем чашки и пробирки замачивают, кипятят в водопроводной воде и моют с последующим ополаскиванием дистиллированной водой.

Подготовка проб воды

Прежде чем приступить к посеву, пробу необходимо тщательно перемешать и обработать горящим тампоном край емкости с тем, чтобы устранить его возможное загрязнение во время транспортирования. На используемых для посева пробирках и чашках необходимо обозначить номер пробы, объем воды или разбавление, дату посева.

Перед каждым отбором новой порции воды для анализа пробу необходимо перемешать стерильной пипеткой.

Определение колиформных бактерий в воде методом мембранных фильтров

Фильтровальный аппарат обтирают ватным тампоном, смоченным спиртом, и фламбируют. После охлаждения на нижнюю часть фильтровального аппарата (столик) фламби-рованным пинцетом кладут стерильный мембранный фильтр, прижимают его верхней частью прибора (стаканом, воронкой) и закрепляют устройством, предусмотренным конструкцией прибора.

В верхнюю часть прибора наливают точно отмеренный объем воды, затем создают вакуум в нижней части прибора.

При фильтровании 1 мл исследуемой воды или ее разбавлении в воронку предварительно следует налить не менее 10 мл стерильной водопроводной воды, а затем внести анализируемую воду.

После окончания фильтрования воронку снимают, флам-бированным пинцетом фильтр осторожно приподнимают за край при сохранении вакуума для удаления излишка воды на нижней стороне фильтра, а затем переносят его, не переворачивая, на питательную среду, разлитую в чашки Петри, избегая пузырьков воздуха между средой и фильтром. Поверхность фильтра с осевшими на ней бактериями должна быть обращена вверх.

На одну чашку можно поместить 3—4 фильтра с условием, чтобы фильтры не соприкасались.

Выполнение анализа

При исследовании воды на выходе с водопроводных сооружений и в распределительной сети необходимо анализировать 3 объема по 100 мл. Точно отмеренный объем воды фильтруют через мембранные фильтры с соблюдением вышеуказанных требований.

Фильтры помещают на среду Эндо, ставят в термостат вверх дном и инкубируют посевы при температуре (37 + 1)°С в течение 24 + 2 часов.

Учет результатов

Результат считается отрицательным, если на фильтрах вообще не выросли колонии или выросли колонии с неровными краями и поверхностью (пленчатые, губчатые, плесневые, прозрачные, слизистые).

При сливном росте на всех фильтрах проводят рассев на среде Эндо для получения изолированных колоний обычными бактериологическими методами.

При наличии типичных лактозоположительных колоний, дающих отпечаток на обратной стороне мембранного фильтра и среде — темно-красных, красные с металлическим блеском и без него, а также лактозоотрицательных — розовых без отпечатков, подсчитывают число колоний каждого типа.

Для идентификации отбирают не менее 5 колоний каждого вида, делают их посев на скошенный агар и далее изучают биохимические тесты. В качестве подтверждающих используют оксидазный тест и тест образования кислоты и газа при ферментации лактозы или маннита (глюкозы).

Для определения оксвдазной активности на фильтровальную бумагу надо поместить 2—3 капли свежеприготовленного реактива для океидазного теста. Заранее приготовленные бумажки смачивают дистиллированной водой. Стеклянной палочкой помещают мазок свежей культуры на подготовленную бумагу. Реакция считается положительной, если в течение 10—30 с появляется фиолетово-коричневое или синее окрашивание.

Культуры, давшие оксидазоположительные реакции, дальнейшему исследованию не подлежат, так как к общим колиформным бактериям относятся грамотрицательные, не образующие спор палочки, не обладающие оксидазной активностью, ферментирующие лактозу или маннит с образованием альдегида, кислоты и газа при температуре 37°С в течение 24 часов.

Термотолерантные колиформные бактерии являются показателями свежего фекального загрязнения и обладают всеми признаками общих колиформных бактерий, которые кроме того способны ферментировать лактозу до кислоты и газа при температуре 44°С в течение 24 часов.

Все типичные лактозоположительные колонии засевают в подтверждающие среды с лактозой и маннитом и инкубируют в течение 24 часов при температуре 37 °С для определения общих колиформных бактерий.

Для определения термотолерантных бактерий посев производят в среду, предварительно прогретую до температуры 44 °С, и инкубируют при этой же температуре в течение 24 часов.

Колонии учитывают как общие колиформные бактерии при отрицательном оксидазном тесте, ферментации лактозы или маннита (глюкозы) при температуре 37°С с образованием кислоты и газа. Среди этих колоний учитывают как термотолерантные колиформные бактерии при оксидазном тесте и ферментации лактозы при температуре 44 °С с образованием кислоты и газа.

Если при выборочной проверке колоний одного типа получены неодинаковые результаты, то для вычисления числа колиформных бактерий среди этих колоний используют формулу:

где х — число колоний одного типа; а — общее число колоний этого типа; b — число проверенных из них; с — число колоний с положительным результатом.

Вычисление и представление результатов

Результат анализа выражают числом колоний образующих единиц (КОЕ) общих колиформных бактерий в 100 мл воды. Для подсчета результата суммируют число колоний, подтвержденных как общие колиформные бактерии, выросших на всех фильтрах, и делят на 3.

Примеры. При посеве трех фильтров по 100 мл выросло две колонии на одном, на остальных двух фильтрах нет роста. Число общих колиформных бактерий будет: 2:3 = = 0,7 КОЕ в 100 мл.

Определение общего числа микроорганизмов, образующих колонии на питательном агаре

Метод определяет в питьевой воде общее число мезо-фильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов (ОМЧ), способных образовывать колонии на питательном агаре при температуре 37°С в течение 24 часов, видимые с увеличением в 2 раза.

Выполнение анализа

Из каждой пробы отобранной воды должен быть сделан посев не менее двух объемов по 1 мл. После тщательного перемешивания пробы воды вносят по 1 мл в стерильные чашки Петри, сразу же в каждую чашку вливают 6—8 мл расплавленного и остуженного до 45—46°С питательного агара. Затем смешивают содержимое чашек, равномерно распределяя по всему дну, избегая образования пузырьков воздуха, попадания агара на края и крышку чашки.

После застывания агара чашки с посевами помещают в термостат при температуре 37 °С на 24 часа.

Вычисление и представление результатов

Должны быть подсчитаны все выросшие на чашке колонии, наблюдаемые при увеличении в 2 раза. Подсчет следует производить только на тех чашках, на которых выросло не более 300 изолированных колоний.

Подсчитанное количество колоний на каждой чашке суммируют и делят на два. Результат выражают числом колоний образующих единиц (КОЕ) в 1 мл исследуемой пробы воды.

Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий титрационным методом

Титрационный метод может быть использован:

при отсутствии материалов и оборудования, необходимых для выполнения анализа методом мембранной фильтрации; при анализе воды с большим содержанием взвешенных веществ;

* в случае преобладания в воде посторонней микрофлоры, препятствующей получению на фильтрах изолированных колоний общих колиформных бактерий.

Выполнение анализа

При исследовании питьевой воды централизованного водоснабжения засевают 3 объема по 100 мл (анализ качественный). При исследованиях воды с целью количественного определения общих колиформных бактерий и при повторном анализе производят посев: 3 объемов по 100 мл, 3 объемов по 10 мл, 3 объемов по 1 мл. Каждый объем исследуемой воды засевают в лактозо-пептонную среду. Посев 100 мл и 10 мл воды производят в 10 и 1 мл концентрированной лак-тозо-пептонной среды, посев 1 мл пробы проводят в 10 мл среды обычной концентрации.

Посевы инкубируют при температуре 37° С в течение 24— 48 часов. После 24 часов инкубации проводят предварительную оценку посевов. Из емкостей, где отмечено наличие роста и образование газа, производят высев на сектора типичных для лактозоположительных бактерий колоний, дают положительный ответ на присутствие общих колиформных бактерий.

Вычисление результатов

При исследовании трех объемов по 100мл результаты оцениваются качественно, и при обнаружении общих или термотолерантных колиформных бактерий хотя бы в одном из трех объемов делают запись в протоколе «обнаружены» в 100 мл.

При исследовании количественным методом, после определения положительных и отрицательных результатов на наличие общих и термотолерантных колиформных бактерий в объемах воды, посеянных в среду накопления, вычисляют наиболее вероятное число бактерий в 100 мл пробы (таблица).

Расчет наиболее вероятного числа бактерий в 100 мл питьевой воды

Определение колифагов прямым методом

Проведение анализа

Накануне проведения анализа необходимо сделать посев Е. coli на косяк с питательным агаром.

Перед проведением анализа сделать смыв бактерий с этого косяка 5 мл стерильной водопроводной воды и по стандарту мутности приготовить взвесь Е, coli в концентрации 109 бактериальных клеток в 1 мл.

Расплавить и остудить до 45°С 2%-и питательный агар.

Исследуемую воду (100 мл) внести в 5 стерильных чашек Петри по 20 мл в каждую. В питательный агар добавить смыв Е. coli из расчета 1,5 мл смыва бактерий на 150 мл агара и осторожно перемешать. Полученной смесью по 30 мл залить сначала пустую чашку Петри (контроль газона Е. coli), а затем все чашки, содержащие исследуемую воду. Содержимое чашек осторожно перемешать. Чашки оставить при комнатной температуре для застывания, а затем вверх дном поместить в термостат для инкубирования при температуре 37°С.

Учет результатов

Учет результатов проводят путем подсчета и суммирования бляшек, выросших на 5 чашках Петри. Результаты выражают в бляшкообразующих единицах (БОЕ) на 100 мл пробы воды. В контрольной чашке бляшки колифагов должны отсутствовать.

Для проведения текущего контроля качества питьевой воды используют метод определения колифагов.

Колифаги — бактериальные вирусы, способные лизиро-вать Е. coli и формировать при температуре 37 + 1°С через 18 + 2 г зоны лизиса бактериального газона (бляшки) на питательном агаре.

Исследуемую пробу воды (100 мл) и чашку Петри с контролем Е. coli помещают в термостат на 18—20 часов при температуре 37 + 1°С.

Для контроля культуры 0,1 мл смыва бактерий Е. coli (или 0,2 мл 4-часовой бульонной культуры) помещают в чашку Петри и заливают питательным агаром.

После инкубации из исследуемой пробы воды в пробирку отливают 10 мл и добавляют 1 мл хлороформа. Пробирку закрывают стерильной резиновой или силиконовой пробкой, энергично встряхивают и оставляют при комнатной температуре не менее 15 мин до полного осаждения хлороформа.

В предварительно расплавленный и остуженный до 45— 49° С питательный агар добавляют приготовленный смыв бактерий Е. coli из расчета 1,0 мл смыва на 100 мл агара,

В стерильную чашку Петри пипеткой из пробирки переносят 1 мл обработанной хлороформом пробы и заливают смесью расплавленного и остуженного до 45—49°С питательного агара объемом 12—15 мл, а также одну дополнительную чашку Петри для контроля культуры Е. coli, перемешивают и оставляют на столе до полного застывания агара, затем чашки Петри ставят в термостат на 18 + 2 ч при 37°С.

Учет результатов

Просмотр посевов осуществляют в проходящем свете. Проба считается положительной при наличии полного лизиса, просветления нескольких бляшек, одной бляшки на чашке с пробой воды при отсутствии зон лизиса на контрольной чашке. При наличии зон лизиса в контроле — результат считается недействительным.