Микробы

Вся совокупность полученных знаний о механизме биодеградации фосфорорганических соединений с С—Р-связью послужила основой для создания биотехнологии защиты окружающей среды от этих токсичных веществ в рамках проекта МНТЦ № 1892.2 «Создание новой технологии биоремедиации почв, загрязненных фосфорорганическими ядохимикатами, с помощью микроорганизмов-деструкторов» (с 1 февраля 2005 г. по 30 апреля 2008 г.).

Участвующие институты:

Исследования финансировала Канада.

Во время экспедиционных поездок в различные регионы России (Московская, Ленинградская, Саратовская, Волгоградская и Самарская области, Краснодарский Край) были отобраны образцы почв, длительное время загрязняемых фосфорорганическими пестицидами и ядохимикатами. Пробы отбирали возле складов ядохимикатов; на сельскохозяйственных полях, в течение 2-5 лет обрабатываемых глифосатом и другими гербицидами; в окрестностях полигонов, где проводилась ликвидация химического оружия.

Для выделения микроорганизмов почвенную суспензию высевали на чашки Петри с плотной питательной средой ФГРМ и инкубировали в термостате при t=+28 по Цельсию. Выросшие колонии микроорганизмов просматривали, отбирали отдельные колонии и пересевали.

На следующем этапе выделяли чистые культуры микроорганизмов, способные к разложению ФОС с прямой С—Р связью, – глифосата и метилфосфоновой кислоты. Выделение проводили на минимальных солевых питательных средах, где в качестве единственного источника фосфора присутствовали в различных концентрациях глифосат (ГФ) или метилфосфоновая кислота (МФК).

При этом микроорганизмы разделились на 3 группы. Ряд штаммов, выделенных из почв, загрязненных глифосатом, разлагали как глифосат, так и после длительной адаптации метилфосфоновую кислоту (1 группа), или только глифосат (2 группа). Микроорганизмы, выделенные из почвы, загрязненной метилфосфоновой кислотой, разлагали только метилфосфоновую кислоту (3 группа).

Проведено изучение деструктивных свойств отобранных штаммов микроорганизмов-деструкторов ФОС и первичный скрининг наиболее активных по деструктивной способности штаммов. Разложение глифосата микроорганизмами изучали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и спектрофотометрическим методом с хромогенным реагентом – малахитовым зеленым.

Генотипирование выделенных штаммов осуществляли методом rep-ПЦР с использованием праймера BoxA1R (5’ CTA CGG CAA GGC GAC GCT GAC G 3’), который путем сравнения наборов амплифицированных участков ДНК позволяет установить степень генетического родства (или различия) между ними. Были получены фингерпринты для отобранных 24 штаммов-деструкторов МФК и ГФ.

В работе использовали охарактеризованную дерново-подзолистую почву. В опытные стаканы вносили глифосат в виде Ground Bio в количестве 25 мл 0,03% раствора (по объему) на стакан. Культуры микроорганизмов для обработки нарабатывали одновременно в термостатируемой качалке при +28 по Цельсию до одинаковой концентрации на жидкой среде MS1 с глифосатом. Непосредственно сразу после внесения микроорганизмов-деструкторов и через 30 суток инкубирования при комнатной температуре отбирали образцы почвы для оценки ее фитотоксичности, интегральной токсичности, для химического и микробиологического анализов.

Биотестирование на дафниях показало, что внесение микроорганизмов-деструкторов в загрязненную почву приводит к снижению ее интегральной токсичности.

Дегидрогеназная активность почвы обусловлена активностью находящейся в ней аборигенной микрофлоры. Этот интегральный показатель показывает угнетение микробиологической активности в почве под действием какого-либо загрязнителя. Установлено, что загрязнение почвы глифосатом приводит к снижению ее дегидрогеназной активности.

В результате лабораторных исследований по микробной деструкции глифосата для полевых экспериментов были отобраны 2 наиболее эффективных штамма – Kg16 и Kg18. Деструктивные свойства этих штаммов исследовали также в аспекте одновременного внесения с С–Р-лиазным ферментным комплексом.

Анализ динамики деградации глифосата с участием шт. Kg16 показал, что процесс разложения этого гербицида проходил более интенсивно при внесении штамма-деструктора, выращенного на минимальной ростовой среде, нежели выращенного на богатой среде ФГРМ. В то же время качественный состав питательных сред не оказал влияния на деструктивные свойства шт. Kg18.

Внесение в почву С–Р лиазного ферментного комплекса не повлияло на деградацию глифосата. Вероятно, он инактивировался почвенными ферментами.

Оценку безопасности штаммов проводили на базе виварного комплекса НИЦ ТБП на лабораторных линиях беспородных белых мышей и крыс по общепринятым методикам. Содержание лабораторных животных в виварии соответствовало требованиям GLP. Изучение патогенных свойств выделенных штаммов проводили в соответствии с международными требованиями по 4 показателям.

По показателям вирулентности, диссеминации, токсичности и токсигенности отобранные штаммы не патогенны для теплокровных животных и могут быть отнесены к 4-му классу опасности. Следовательно, эти штаммы пригодны для использования в процессах биоремедиации без ограничений.

Помимо этого, проводили изучение токсичности микробного ферментного комплекса для лабораторных теплокровных животных (белых мышей и крыс). Для получения бесклеточного экстракта культуру Kg18 выращивали на качалке в колбах объемом 750 мл со 100 мл минеральной среды MS1 c 10 г/л глутамата и 0,5 г/л глифосата. Получение ферментного комплекса проводили экструзией микробной суспензии из замороженного состояния на прессе Хьюза при рабочем давлении 3200 кг/см2.

Ферментный комплекс вводили внутрижелудочно шести самкам и шести самцам аутбредных мышей массой тела 20 г в дозе 50 мл (50000 мг)/кг, а также шести самкам и шести самцам крыс линии Wistar массой тела 180 г в дозе 20 мл (20000 мг)/кг. Испытанные дозы по объему являлись максимально допустимыми для введения в желудок. Введение осуществляли при помощи металлических зондов, соответствующих размерам видов животных.

Результаты экспериментов на белых мышах и крысах показали, что С–Р-лиазный ферментный комплекс штамма Kg18 по параметрам острой токсичности при внутрижелудочном введении может быть отнесен к 4-му классу опасности (не токсичен).

Следовательно, С–Р-лиазный ферментный комплекс можно использовать без ограничений в экспериментах по биоремедиации почвы от глифосата.

Следующим этапом исследований было проведение микроделяночных полевых испытаний по биоремедиации почв, загрязненных глифосатом, с помощью 2 штаммов микроорганизмов-деструкторов – Kg16 и Kg18. На полигоне было подготовлено 7 участков размеров 1 х 2 метра каждый. Почву на участках перекопали, удалили корни растений и прорыхлили. Затем в нее внесли Ground Bio из расчета 100 л ГФ/га.

Микробную биомассу обоих штаммов одновременно нарабатывали в ферментерах на однотипной среде. Полученную суспензию контролировали на численность микроорганизмов методом кратных разведений, высевом на плотные питательные среды. Концентрация штамма Kg16 составила (3,7 ± 0,69)•100 000000, а штамма Kg18 – (6,4 ± 0,5)•100000000 КОЕ/мл. В почву микробную суспензию вносили из расчета 1 литр на 1 м2.

Результаты химического анализа показали, что под действием микроорганизмов-деструкторов происходит снижение концентрации внесенного глифосата. Естественная убыль глифосата за 28 суток эксперимента составила 55%, то есть немногим больше половины исходной концентрации. Внесение в почву питательной среды не увеличивало степень деградации, различия с контролем носили недостоверный характер. Внесение штаммов-деструкторов статистически достоверно увеличивало разложение глифосата в почве до 73% (штамм Kg18) и 87% (штамм Kg16). Миграции глифосата по почвенным горизонтам во всех вариантах опыта во время биоремедиации не выявлено. Таким образом, штамм Kg16 обладает большей деструктивной активностью, нежели штамм Kg18.

Проведена оценка фитотоксичности почвы, загрязненной глифосатом, до и после микробной ремедиации. Глифосат, внесенный в дозе 100 л/га, обладал фитотоксичностью для овса в течение всего эксперимента. Это проявилось в достоверном уменьшении (в 1,5 раза) длины корешков овса по сравнению с контролем (чистая почва). Во время проведения биоремедиации выявлено достоверное снижение фитотоксичности почвы на участках с питательной средой – в 1,3 раза, со штаммом Kg18 – в 1,5 раза, со штаммом Kg16 – в 2,9 раза по сравнению с почвой, загрязненной глифосатом.

Контроль за численностью микроорганизмов в почве во время биоремедиации показал, что концентрация аборигенной почвенной микрофлоры изменилась незначительно (в соответствии с погодными условиями). Численность микроорганизмов-деструкторов Kg16 и Kg18 в ходе биоремедиации постепенно снижалась.

Интегральную токсичность почвы, загрязненной ГФ, до и после биоремедиации оценивали на дафниях Daphnia magna. Образцы почвы отбирали в день внесения микроорганизмов-деструкторов, через 7, 14, 21 и 28 суток. Результаты биотестирования показали, что во всех вариантах опыта почва не токсична.

Дегидрогеназная активность почвы является индикатором активности почвенного микробного комплекса. Результаты экспериментальных исследований показали, что загрязнение почвы глифосатом приводит к снижению ее дегидрогеназной активности. Внесение микроорганизмов-деструкторов способствовало восстановлению биологических свойств почвы, то есть ее реабилитации.

Экспериментальное изучение токсичности почвенных экстрактов проводили на самцах белых крыс линии Wistar. Из образцов почвы до и после биоремедиации готовили водные экстракты. Лабораторным животным в течение всего эксперимента (62 суток) выпаивали экстракты из почвы. Ежедневно отмечали количество выпитой жидкости, оценивали клиническое состояние животных.

У животных проводили гематологическое и биохимическое изучение основных показателей крови, биохимическое исследование мочи; патоморфологическое изучение органов и тканей.

Результаты токсикологических испытаний показали, что почва, загрязненная глифосатом, оказывает токсическое действие на организм лабораторных животных. У животных при выпаивании экстракта загрязненной почвы достоверно уменьшается общее количество эритроцитов и лейкоцитов, уменьшается гематокритная величина, снижается общее количество гемоглобина. Отмечено увеличение количества эозинофилов.

При изучении морфологии клеток в мазках периферической крови крыс, подвергшихся выпаиванию экстрактом загрязненной почвы, зафиксировано появление единичных (1-2%) нейтрофилов с выраженной оксидазной реакцией цитоплазмы и единичных (1-2%) эозинофилов с выраженной пероксидазной реакцией цитоплазмы.

При анализе биохимических показателей сыворотки крови у животных, получавших экстракт загрязненной почвы, статистически достоверно повысился уровень глюкозы, холестерина и снизился уровень креатинина.

При микроскопическом исследовании структуры органов животных не установлено каких-либо специфических изменений, связанных с действием загрязненной почвы.

У животных, получавших экстракт из почвы после биоремедиации, проведенными токсикологическими исследованиями установлено снижение его общей токсичности до показателей чистой почвы.

Следовательно, проведение микробной биоремедиации почвы, загрязненной фосфорорганическими соединениями (глифосатом), приводит к снижению интегральной почвенной токсичности. Продукты микробного разложения глифосата не токсичны для лабораторных теплокровных животных.

Заключение

По результатам лабораторных и микрополевых исследований из 24 потенциальных штаммов микроорганизмов отобран наиболее активный штамм Achromobacter sp. Kg16, пригодный для биоремедиации почвы, загрязненной ФОС.

Проведена идентификация и характеристика ферментного комплекса С–Р лиазы. Установлено, что белки С–Р-лиазного комплекса локализованы во всех компартментах клетки. Полученная in vitro С–Р-лиазная активность не превышает 2% от клеточной активности. Следует подчеркнуть, что данный результат – пока месть первая в мировой практике удачная и достоверная попытка обнаружения С–Р-лиазной активности неинтактных (разрушенных) клеток.

Разработана и апробирована в лабораторных и микрополевых условиях технология биоремедиации “in situ” почвы, загрязненной фосфорорганическими соединениями, с помощью микроорганизмов-деструкторов штамма Achromobacter sp. Kg16. Данная технология экологически безопасна, обладает высокой эффективностью и может быть рекомендована для практического использования.

Составлен паспорт штамма Achromobacter sp. Kg16 для его последующего депонирования в Международной коллекции промышленных организмов.