Микробы

Известно, что микроорганизмы, выделенные из природных источников, обладают весьма низкой антибиотической активностью. Например, различные штаммы Penicillium, изолированные из почвы и других естественных субстратов, образуют пенициллин в пределах 10—30 ед/мл. Продуцент стрептомицина (Sir. griseus), выделенный из хорошо унавоженной почвы, образует не более 100 мкг/мл антибиотика. Примерно такого порядка активностями обладают и другие продуценты антибиотиков, выделенные из природы (так называемые дикие штаммы).

Разумеется, современная антибиотическая промышленность не могла бы работать с такими низкоактивными продуцентами. Да и стоимость антибиотиков была бы необычайно высокой, что резко ограничило бы использование их в медицинской практике и в сельском хозяйстве. В этой связи перед учеными была поставлена задача получить высокопродуктивные штаммы. Поставленная задача успешно решена.

В настоящее время в промышленности используются такие штаммы, которые образуют антибиотики на 2—3 порядка выше по сравнению с исходными, «дикими», продуцентами. Так, по данным Polinson (1974), получены штаммы Penicillium chrysoge-пит, образующие до 25 000 ед/мл пенициллина.

Каковы же основные способы, позволяющие значительно повысить биосиитетическую активность продуцентов антибиотиков? Можно назвать два основных способа:

1) получение из исходных штаммов новых генотипов микроорганизмов, обладающих повышенной активностью в отношении синтеза антибиотика;

2) подбор наиболее благоприятных для максимального образования антибиотиков условий культивирования отобранных мутантов.

Существуют, как известно, два процесса, способные вызывать новые генотипы микроорганизмов: мутационный процесс и процесс рекомбинации.

Мутация в сочетании с селекцией используется в качестве основного приема в улучшении штаммов микроорганизмов — продуцентов антибиотиков. Как правило, применяют комбинацию процесса мутации и селекцию, процесса рекомбинации и селекцию или же и того и другого вместе (мутации, рекомбинации и селекцию), так как одной селекцией невозможно решить указанную проблему.

Мутации получают в результате обработки исходного штамма сильнодействующими мутагенными факторами; вегетативные клетки или споры облучают рентгеновским и ультрафиолетовым излучением, обрабатывают клетки (споры) азотистой формой иприта, этиленимином и другими мутагенными веществами. Режим обработки подбирают такой, при котором большинство клеток или спор погибают. У выживших клеток (спор) в этих экстремальных условиях могут возникнуть глубокие физиологические изменения, появиться новые генотипы. Наряду с вариантами, вообще потерявшими способность к биосинтезу антибиотика (их обычно бывает большинство), появляются формы с повышенной способностью антибиотикообразования.

Методами селекции выделяют наиболее активные варианты, которые вновь могут быть подвергнуты обработке мутагенными факторами. Такие операции повторяют несколько раз. В результате ступенчатого отбора удается получить мутанты, обладающие в несколько раз более высокой антибиотической активностью по сравнению с исходным штаммом.

Применение метода генетической рекомбинации так же дает возможность получать штаммы организмов, обладающие повышенным синтезом антибиотических веществ. Эти методы используют для получения высокоактивных продуцентов среди собственно бактерий, актиномицетов, мицелиальных грибов.

Существенное значение в увеличении выхода антибиотиков имеет подбор соответствующих условий культивирования выделенных мутантов. Под условиями культивирования понимают комплекс факторов окружающей среды, влияющих на развитие микроорганизма и определяющих его биосинтетическую активность (состав среды, степень ее аэрации, температура, значение активной кислотности (рН) и другие факторы).

При разработке (подборе) среды для культивирования необходимо уделять большое внимание формам источников азота, углерода, фосфора и других компонентов питания, их концентрации и соотношению в среде, наличию в субстрате (если это необходимо) соответствующих предшественников биосинтеза молекулы антибиотика, необходимых витаминов, микроэлементов и других веществ.

Источники азота. Для многих микроорганизмов-продуцентов антибиотических веществ легко усвояемыми формами азота служат аммонийные соли и аминокислоты; последние оказывают заметное влияние на метаболизм организмов. Связано это с тем, что аминокислоты принимают непосредственное участие в синтезе белков (структурных и ферментативных), полипептидов, в образовании ряда антибиотиков. Кроме этого, аминокислоты могут оказывать влияние на ферментные системы: индуцировать или распрессировать их образование, активировать или ингибиро-вать их активность.

Однако ряд микроорганизмов образуют антибиотики лишь в том случае, если в среде присутствует азот в окисленной форме (в виде нитратов). К таким организмам можно отнести продуценты аурантина (Streptornyces auranticus), альбомицина (Str. subtropicus)., Биосинтез пенициллина идет гораздо активнее, если в среде наряду с аммонийным источником азота присутствует нитрат.

В натуральных средах неопределенного состава, включающих соевую муку, кукурузную муку, пшеничную муку, кукурузный экстракт и другие растительные или животные продукты, азот содержится преимущественно в форме белков, полипептидов и аминокислот.

Источники углерода. Источники углерода оказывают существенное влияние на метаболизм микроорганизмов и образование ими антибиотиков. Приведем примеры, показывающие значение источников углерода при биосинтезе некоторых антибиотиков.

Так, для производства пенициллина культурой Penicillium chrysogenum лучшим источником углерода является сочетание глюкозы и лактозы. Однако глюкоза может быть использована в этом процессе в качестве единственного источника углерода, если она будет вводиться в среду дробно небольшими порциями по ходу развития гриба.

Образование грамицидина С может происходить на относительно простой по составу синтетической среде, в состав которой в качестве источника углерода входят глицерин и янтарная кислота (янтарнокислый аммоний).

Лучшим источником углерода для развития продуцента стрептомицина и образования им антибиотика считается глюкоза. Некоторые штаммы Str. griseus не способны использовать сахарозу и рафинозу.

Продуцент неомицина Str. fradiae лучше развивается на синтетической среде с глюкозой, чем на среде, содержащей соевую муку. Однако образование антибиотика на синтетической среде примерно в 8 раз ниже, чем при развитии актино-мицета на среде с соевой мукой.

Биосинтез хлортетрациклина происходит на высоком уровне в том случае, если Str. aureofaciens работает в среде, содержащей в качестве источника углерода глюкозу. Актиномицет может использовать также жиры, некоторые органические кислоты, крахмал, глицерин.

Для каждого продуцента антибиотика с целью наилучшего развития и высокого уровня образования антибиотика необходимо подбирать не только соответствующие источники углерода, но и их концентрацию в среде, правильные соотношения азота и углерода.

Например, для продуцента тетрациклина Sir. auerofaciens концентрация глюкозы в среде, равная 50. мг/мл при содержании 2,4 мг/мл азота аммония, способствует хорошему росту актиномицета и высокому уровню биосинтеза антибиотика. Увеличение концентрации глюкозы до 80—85 мг/мл ингибирует рост актиномицета, а 26 мг/мл сахара не обеспечивает нормальный рост продуцента тетрациклина.

Фосфор. Огромное значение для роста микроорганизмов и образования ими антибиотиков имеет концентрация фосфора в среде.

Недостаток или избыток фосфора в среде резко сказывается на обмене веществ микроорганизмов и, следовательно, на процессе биосинтеза антибиотика. Это особенно заметно проявляется на образовании таких антибиотиков, как тетрациклины, макро-лиды и некоторые другие, биосинтез которых связан с углеродным обменом.

Левитов и Бринберг1 условно разделили продуценты антибиотиков в связи с их чувствительностью к концентрации фосфора в среде на три группы.

1. Высокочувствительные организмы, для которых оптимальная концентрация фосфора в среде составляет менее 10 мг% (продуценты тетрациклинов, нистатина, флоримицина, ванко-мицина).

2. Организмы средней чувствительности, для которых оптимальная концентрация фосфора в среде составляет 10—15 мг% (продуценты стрептомицина, эритромицина, циклосерина, неоми-цина).

3. Малочувствительные организмы, для которых оптимальная концентрация фосфора равняется 18—20 мг% (продуценты новобиоцина, грамицидина С, олеандомицина).

Большое влияние на биосинтез антибиотиков оказывают и другие компоненты среды, в том числе сера, марганец, магний, железо, цинк, кобальт,

Предшественники биосинтеза антибиотиков. В ходе биосинтеза некоторых антибиотиков большую роль в увеличении их выхода оказывают так называемые предшественники биосинтеза — органические вещества субстрата, которые в процессе образования антибиотика тем или иным способом включаются в его молекулу без предварительного расщепления на отдельные фрагменты и последующего синтеза. Например, при образовании молекул пенициллина предшественниками выступают фенил-уксусная кислота и ее производные.