Микроорганизмы:

Стрептококк

News image

Стрептококк (лат. Streptococcus) — род шаровидных или овоидных аспорогенных грамположительных хемоорганотрофных факуль...

Пневмококк

News image

Пневмококк (Streptococcus pneumoniae) (син.: Вейксельбаума диплококк, Френкеля диплококк, Diplococcus pneumoniae, Micr...

Основы вирусологии:

Исследование консервов

Бактериологическое исследование готовых консервов проводится по ГОСТ 30425—97. Консервы. Метод определения промышленно...

Санитарно-микробиологическое исследование объектов окружающей среды в лечебно-профилактических учреж

Объектами исследования при проведении бактериологического контроля лечебно-профилактических учреждений являются: во...

Госпитальные инфекции

Определение понятия. Госпитальными инфекциями являются эндогенные и экзогенные инфекции, приобретенные больными в меду...

Авторизация





Криосохранение

криосохранение

Криосохранение - замораживание при сверхнизких температурах. Обычно его проводят в жидком азоте, при температуре - 196oC.

Успех низкотемпературной консервации зависит от ряда факторов:

Существенную роль в успешном замораживании клеток играет их морфофизиологическое состояние: клетки, находящиеся в стационарной фазе роста, менее устойчивы к повреждающему действию низкотемпературной консервации, чем клетки, находящиеся в экспоненциальной фазе роста. Клетки для замораживания отбирают в середине экспоненциальной фазы ростовой кривой.

Немаловажное значение имеет и плотность замораживаемой суспензии. Оптимальные результаты по восстановлению клеток были получены при замораживании клеточной суспензии плотностью 1*105 - 5*106 клеток в 1 мл.

Для растительных клеток часто требуется предварительное культивирование в особых условиях. В среду добавляют различные вещества, например:

Процесс замораживания растительных клеток от животных отличает, в основном, наличие этапа предварительного культивирования.

Криопротекторы - вещества, позволяющие снизить повреждающее действие физико-химических факторов при криоконсервировании. К ним относятся сахароза, декстран, этиленгликоль, поливинилпирролидон, диметилсульфоксид (ДМСО), глицерин. Для определения токсичности криопротектора клетки выдерживают при комнатной температуре в различных его концентрациях в течение 30 - 50 минут, после чего определяют их жизнеспособность. Дополнительно оценивают его протективные свойства путем пробного замораживания и оттаивания культур. Наиболее часто в качестве криопротекторов используют глицерин и ДМСО. Перед добавлением криопротектора суспензию клеток концентрируют путем центрифугирования, надосадочную жидкость сливают. Криопротекторы вносят в культуру за час до замораживания, что приводит к изменению проницаемости мембраны, изменению точки замерзания и оттаивания.

Программы охлаждения могут быть различными, но для всех них характерна медленная скорость охлаждения. При замораживании происходит образование льда внутри и снаружи клеток. Характер этих изменений зависит от изучаемого образца и обработки криопротекторами, но главным образом, от скорости охлаждения. При медленном охлаждении происходит образование внеклеточного льда, приводящее к обезвоживанию клетки до того, как будет достигнута точка замерзания цитоплазмы. При быстром охлаждении клетки быстрее замораживаются изнутри, медленнее обезвоживаются, что приводит к образованию кристаллов льда внутри клетки. В этом случае клетки повреждаются. Обычно охлаждение проводят в два этапа.

1-й этап: от +20 до - 28oC со скоростью 1 градус в минуту (для растительных клеток скорость замораживания 0,5 градуса в минуту до - 35оС), выдерживают при этой температуре 15 минут.
2-ой этап: погружение в жидкий азот (мгновенное охлаждение до - 196oC).

Замораживание производят в специальных аппаратах. При их отсутствии - на спиртовой бане (0,5 - 1 литр спирта наливают в термос с металлической колбой, погружают в него ампулы на 15 минут и добавляют при помешивании жидкий азот или сухой лед; доводят температуру до - 32oC (температура должна быть не выше - 28 и не ниже - 32оС). Далее переносят ампулы в жидкий азот.

При размораживании ампулы пинцетом переносят в водяную баню с температурой +37 - +40оС, ампула объемом в 1 мл размораживается в течение 0,5 - 1 минуты.

После размораживания клетки отмывают либо в ростовой среде (животные), либо в поддерживающей среде. Растительные клетки также можно отмывать 3 - 10% раствором сахарозы.

Далее клетки проверяют на жизнеспособность с помощью витальных красителей, окрашивающих мертвые клетки. Окончательным критерием служит четкое возобновление роста на стандартных питательных средах, используемых для данной культуры.

Перевиваемые культуры животных клеток после размораживания имеют повышенную чувствительность к вирусам, которая проявляется в течение первых двух пассажей. Далее чувствительность возвращается к исходной.




Читайте:


Добавить комментарий


Защитный код
Обновить

Микроорганизмы и человек:

Причина тифа

Еще одним примером инфекционного заболевания, не имеюще­го бактериальной природы, является брюшной тиф. Это заболе­ван...

Что у нас внутри

Кодирующие последовательности 16S РНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) извлекали непосредственно из «окружа...

Биохимия: липиды

Липиды являются органическими веществами, которые характерны для всех живых на земле организмов, они не растворимы в вод...

Иммунитет:

Опыты Беринга

В 1890 году немецкий военный врач Эмиль Адольф фон Беринг, работавший в лаборатории Коха, попробовал реализовать на пр...

Инструменты организма

Как работает вакцина? Какие изменения в организме проис­ходят после ее введения? Какова химическая природа иммунитета?...

Специфический и неспецифический иммунитет

Устойчивость организма к различным вирусам, инфекциям во многом зависит от иммунитета. Именно хорошая иммунная защита на...