Патогенные микроорганизмыПатогенные микроорганизмы это микроорганизмы паразиты, которые наносят вред своему хозяину. Микроорганизмов паразитов, о... |
Найдены микроорганизмы, обладающие противоопухолевыми свойствами![]() Что мы знаем о влиянии микроорганизмов? Ранее неизвестные науке мельчайшие существа, которые обладают биологической ... |
Схема выделения возбудителя малярии и амебной дизентерииМалярия Окр. по Романовскому—Гимзе (толстая капля, мазок) Серологический метод Парные [ сывороткиh НМФА, РИГА |
Вич-инфекцияВозбудителем ВИЧ-инфекции является вирус иммунодефицита человека: ВИЧ — может быть двух типов (1 и 2) (по-английски HI... |
Вирус бешенстваВозбудитель бешенства относится к семейству Рабдови-русы. Семейство это включает вирусы бешенства, везикулярного стома... |
Криосохранение - замораживание при сверхнизких температурах. Обычно его проводят в жидком азоте, при температуре - 196oC.
Успех низкотемпературной консервации зависит от ряда факторов:
Существенную роль в успешном замораживании клеток играет их морфофизиологическое состояние: клетки, находящиеся в стационарной фазе роста, менее устойчивы к повреждающему действию низкотемпературной консервации, чем клетки, находящиеся в экспоненциальной фазе роста. Клетки для замораживания отбирают в середине экспоненциальной фазы ростовой кривой.
Немаловажное значение имеет и плотность замораживаемой суспензии. Оптимальные результаты по восстановлению клеток были получены при замораживании клеточной суспензии плотностью 1*105 - 5*106 клеток в 1 мл.
Для растительных клеток часто требуется предварительное культивирование в особых условиях. В среду добавляют различные вещества, например:
Процесс замораживания растительных клеток от животных отличает, в основном, наличие этапа предварительного культивирования.
Криопротекторы - вещества, позволяющие снизить повреждающее действие физико-химических факторов при криоконсервировании. К ним относятся сахароза, декстран, этиленгликоль, поливинилпирролидон, диметилсульфоксид (ДМСО), глицерин. Для определения токсичности криопротектора клетки выдерживают при комнатной температуре в различных его концентрациях в течение 30 - 50 минут, после чего определяют их жизнеспособность. Дополнительно оценивают его протективные свойства путем пробного замораживания и оттаивания культур. Наиболее часто в качестве криопротекторов используют глицерин и ДМСО. Перед добавлением криопротектора суспензию клеток концентрируют путем центрифугирования, надосадочную жидкость сливают. Криопротекторы вносят в культуру за час до замораживания, что приводит к изменению проницаемости мембраны, изменению точки замерзания и оттаивания.
Программы охлаждения могут быть различными, но для всех них характерна медленная скорость охлаждения. При замораживании происходит образование льда внутри и снаружи клеток. Характер этих изменений зависит от изучаемого образца и обработки криопротекторами, но главным образом, от скорости охлаждения. При медленном охлаждении происходит образование внеклеточного льда, приводящее к обезвоживанию клетки до того, как будет достигнута точка замерзания цитоплазмы. При быстром охлаждении клетки быстрее замораживаются изнутри, медленнее обезвоживаются, что приводит к образованию кристаллов льда внутри клетки. В этом случае клетки повреждаются. Обычно охлаждение проводят в два этапа.
1-й этап: от +20 до - 28oC со скоростью 1 градус в минуту (для растительных клеток скорость замораживания 0,5 градуса в минуту до - 35оС), выдерживают при этой температуре 15 минут.
2-ой этап: погружение в жидкий азот (мгновенное охлаждение до - 196oC).
Замораживание производят в специальных аппаратах. При их отсутствии - на спиртовой бане (0,5 - 1 литр спирта наливают в термос с металлической колбой, погружают в него ампулы на 15 минут и добавляют при помешивании жидкий азот или сухой лед; доводят температуру до - 32oC (температура должна быть не выше - 28 и не ниже - 32оС). Далее переносят ампулы в жидкий азот.
При размораживании ампулы пинцетом переносят в водяную баню с температурой +37 - +40оС, ампула объемом в 1 мл размораживается в течение 0,5 - 1 минуты.
После размораживания клетки отмывают либо в ростовой среде (животные), либо в поддерживающей среде. Растительные клетки также можно отмывать 3 - 10% раствором сахарозы.
Далее клетки проверяют на жизнеспособность с помощью витальных красителей, окрашивающих мертвые клетки. Окончательным критерием служит четкое возобновление роста на стандартных питательных средах, используемых для данной культуры.
Перевиваемые культуры животных клеток после размораживания имеют повышенную чувствительность к вирусам, которая проявляется в течение первых двух пассажей. Далее чувствительность возвращается к исходной.
Читайте: |
---|
Причина желтой лихорадкиВ виде малярии медики столкнулись с первым инфекционным заболеванием, вызываемым микроорганизмами, не являющимися ба... |
Полезно ли пить кефир молочного грибаЛюбые микроорганизмы условно можно разделить на вредные и полезные для человека. Деление это именно условное, так как ... |
Микробы под ногтямиКаждый человек просто обязан следить за чистотой своих рук, если он уважает себя и окружающих. Ученые американского инст... |
ИнтерферонВ 1957 году группа британских бактериологов, которую возглавлял Алек Айзеке, показала, что клетки при попадании в них... |
Первые победыВ конце XVIII века оспа была особенно страшным заболеванием. Люди боялись оспы не только потому, что эта болезнь час... |
Первая трансплантацияВ строгом смысле у каждого человека есть аллергия по отношению к любому иному человеку. Трансплантат - орган или ткань... |