Микроорганизмы:

Бактерии

News image

Бактерии — это очень простая форма растительной жизни, которая состоит из одной живой клетки. Размножение осуществляет...

Селекция микроорганизмов

News image

Особенности селекции микроорганизмов. В ряды микроорганизмов входят все прокариоты, и часть эукариот – грибы и водоросл...

Основы вирусологии:

Клещевой энцефалит

Переносчики — клещи Ixodes persulcatus и Ixodes ricinus. Резервуарами и переносчиками инфекции в природе являются и...

Кл. Споровики

В этот класс включены паразитические виды простейших. В процессе своего развития имеют стадию так называемой споры, ко...

САНИТАРНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ. Санитарно-микробиологические исследования

Микроорганизмы, и в первую очередь бактерии, распространены в природе гораздо шире, чем другие живые существа. Благода...

Авторизация





Методы тонкой очистки веществ: виды хроматографии

Более тонкую очистку веществ осуществляют несколькими способами.

Наибольшее распространение получила хроматография. Каплю образца наносят на специальную бумагу (хроматография на бумаге) или пластинку стекла или пластмассы, покрытую тонким слоем инертного сорбента, например, целлюлозы или силикагеля (хроматография в тонком слое или тонкослойная хроматография). Затем такую пластинку одним концом помещают в смесь растворителей (например, воды и спирта).

По мере движения растворителей по пластинке, они подхватывают те молекулы образца, которые растворяются в них. Растворители выбирают таким образом, чтобы они связывались сорбентом по-разному. В результате молекулы образца, более растворимые в связанном растворителе, движутся медленнее, а другие, более растворимые в слабо сорбированном растворителе, движутся быстрее. Через несколько часов пластинку сушат, окрашивают и определяют положение различных молекул.

Можно разделять молекулы методом хроматографии на колонках (колоночная хроматография). В этом случае смесь молекул в растворе пропускают через колонку, содержащую твердый пористый матрикс. В результате взаимодействия с матриксом различные молекулы проходят через колонку с различной скоростью. После того как они достигнут в определенной последовательности дна колонки, их собирают отдельными фракциями.

В настоящее время разработано и применяется множество матриксов различных типов, используя которые можно делить белки согласно их:

При ионообменной хроматографии нерастворимый матрикс содержит ионы, задерживающие молекулы с противоположным зарядом. Для разделения молекул используются следующие матриксы: диэтиламиноэтилцеллюлоза (ДЭАЭ-целлюлоза) - заряжена положительно; карбоксиметилцеллюлоза (КМ-целлюлоза) и фосфоцеллюлоза - заряжены отрицательно. Силы взаимодействия между молекулами в растворе и ионообменником определяются ионной силой и рН элюирующего раствора.

Гидрофобные колонки наполнены шариками, из которых выступают гидрофобные цепи; в таких колонках задерживаются белки с обнаженными гидрофобными участками.

Колонки, предназначенные для гель-фильтрации, заполнены крошечными пористыми инертными шариками; при использовании таких колонок происходит разделение белков по размерам. Молекулы небольшого размера по мере прохождения через колонку проникают внутрь шариков, а более крупные молекулы остаются в промежутках между шариками. В результате они быстрее проходят через колонку и выходят из нее первыми. В качестве матрикса можно использовать зерна поперечно-сшитого полисахарида (декстран или агароза).

Гель-фильтрация обычно используется и для разделения молекул, и для определения их размеров.

Гораздо более эффективен метод аффинной хроматографии (хроматография по сродству). В основе этого метода лежат биологически важные взаимодействия, происходящие на поверхности белковых молекул. При аффинной хроматографии используется нерастворимый матрикс, ковалентно связанный со специфичными лигандами (антителами или субстратом ферментов), которые присоединяют определенный белок.

Связываемые иммобилизованным субстратом молекулы фермента можно элюировать концентрированными растворами субстрата в свободной форме, а молекулы, связанные с иммобилизованными антителами, можно элюировать за счет диссоциации комплекса антитело-антиген концентрированными растворами соли или растворами низкого или высокого рН. Однократная хроматография на такой колонке позволяет зачастую достигнуть очень высокой степени очистки препарата.

Разрешение обычной колоночной хроматографии ограничено негомогенностью матриксов (например, целлюлозы), что вызывает неравномерное протекание растворителя через колонку. Разработанные недавно хроматографические смолы (в основу которых обычно положен кремний) имеют форму мельчайших сфер от 3 до 10 мкм в диаметре, которые упакованы в специальный чехол и образуют гомогенную колонку. Такие колонки для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЖХ) обеспечивают высокий уровень разрешения. Поскольку частицы носителя в колонках для ВЖХ упакованы очень плотно, в отсутствие высокого давления скорость потока через них незначительна. По этой причине такие колонки обычно помещают в стальные цилиндры, соединенные со сложной системой насосов и шлангов, которые обеспечивают необходимое для высокой скорости протока давление.

В традиционной колоночной хроматографии скорость протекания через колонку может быть довольно низкой (примерно один объем колонки в час), таким образом, у разделяемых растворов достаточно времени для уравновешивания с внутренним содержимым крупных частиц матрикса. В условиях ВЖХ происходит быстрое уравновешивание растворов с внутренним содержимым крошечных сфер, так что растворы, обладающие различным сродством к матриксу, эффективно разделяются даже при высокой скорости потока. Таким образом, ранее для достижения плохого разделения с помощью колоночной хроматографии требовались часы, а в настоящее время благодаря ВЖХ качественное фракционирование занимает минуты. Вот почему именно этот метод чрезвычайно популярен сейчас для разделения и белков, и малых молекул.




Читайте:


Добавить комментарий


Защитный код
Обновить

Микроорганизмы и человек:

Открытие причины малярии

Из года в год малярия свирепствовала на Земле и уносила больше жизней, чем какое-либо другое инфекционное заболева­ние...

Микроорганизмы кишечника

Микроорганизмы кишечника – это несколько сотен видов различных бактерий. В процентном соотношении 25% составляют бифидоб...

Микробы под ногтями

Каждый человек просто обязан следить за чистотой своих рук, если он уважает себя и окружающих. Ученые американского инст...

Иммунитет:

Эффективная защита для организма

Трудно представить, что сегодня есть препараты, которые могут помочь нашей иммунной системе справляться с разнообразны...

Результат борьбы

Миллионы лет борьбы между нами и микробами дали нам сложнейшую иммунную систему. Самое главное в защите против вирусов...

Новое слово в медицине

Природа большинства заболеваний носит иммунный характер. Это связано с тем, что именно защитная функция организма являет...