Микроорганизмы:

Патогенные микроорганизмы

News image

Патогенные микроорганизмы это микроорганизмы паразиты, которые наносят вред своему хозяину. Микроорганизмов паразитов, о...

Болгарская палочка

News image

Большинство микроорганизмов играют полезную роль для человека. Многие микробы и бактерии свободно разлагают трупы живо...

Основы вирусологии:

Саннтарно-бактериологический контроль методом исследования смывов

  Отбор проб и доставка в лабораторию В практике текущего санитарного надзора за объектами общественного питания, торг...

Вич-инфекция

Возбудителем ВИЧ-инфекции является вирус иммунодефицита человека: ВИЧ — может быть двух типов (1 и 2) (по-английски HI...

САНИТАРНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ. Санитарно-микробиологические исследования

Микроорганизмы, и в первую очередь бактерии, распространены в природе гораздо шире, чем другие живые существа. Благода...

Авторизация





Методы тонкой очистки веществ: двумерный электрофорез

Электрофорез – метод разделения белков и нуклеиновых кислот в свободном водном растворе и пористом матриксе, в качестве которого можно использовать полисахариды, например, крахмал или агарозу. Биомолекулы обычно несут суммарный положительный или отрицательный заряд, обусловленный наличием на их поверхности положительно или отрицательно заряженных групп аминокислот.

Если белковые молекулы поместить в электрическое поле, они начинают перемещаться со скоростью, которая определяется их суммарным зарядом, а также формой и размерами. В середине 60-х годов был разработан модифицированный метод электрофореза - электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГ). При использовании данного метода белки мигрируют в инертном матриксе-полиакриламидном геле с высоким содержанием поперечных сшивок. Обычно гель готовят полимеризацией мономеров непосредственно перед использованием. Размеры пор геля могут быть подобраны произвольно с тем, чтобы гель мог замедлить миграцию определенных молекул. При этом белки находятся в растворе,содержащем мощный, отрицательно заряженный детергент - додецил-сульфат натрия или ДСН (SDS).Связываясь с гидрофобными участками белковой молекулы, этот детергент вызывает развертывание белковых молекул в длинные вытянутые цепи. Каждая молекула белка связывает значительное количество молекул детергента, приобретая суммарный отрицательный заряд. По этой причине белок после того, как будет приложено напряжение, начнет двигаться в направлении положительного электрода.

Белки одного размера ведут себя сходным образом, поскольку,во-первых, их природная структура полностью нарушена ДСН так, что их форма идентична, во-вторых, они связывают одинаковое количество ДСН и приобретают одинаковый негативный заряд. Крупные белки, обладающие большим зарядом, подвергаются действию значительных электрических сил, а также более существенному торможению. В обычных растворах эти эффекты, как правило, взаимно погашаются, но в порах полиакриламидного геля, действующего как молекулярное сито, большие молекулы тормозятся значительно сильнее, чем малые, поэтому оказываются ближе к стартовой линии. Смесь молекул делится на ряд полос, расположенных в соответствии с их молекулярной массой.

Выявить эти полосы можно путем окрашивания соответствующим красителем. Например, белки индентифицируются красителем кумасси синим. Известно, что близко расположенные полосы в геле могут перекрываться. Этот эффект препятствует выявлению большого количества белков (не больше 50) с помощью одномерных методов их разделения.

Метод двумерного гель-электрофореза, в котором объединены две различные процедуры разделения, позволяет идентифицировать более 1000 белков. Результаты при этом получают в виде «двумерной» белковой карты.

При работе данным методом на первом этапе белки разделяют по их заряду. Для этого образец помещают в небольшой объем раствора, содержащего неионный (незаряженный) детергент-меркаптоэтанол, и в качестве денатурирующего агента-мочевину. В этом растворе происходит солюбилизация, денатурация и диссоциация всех без исключения полипептидных цепей; при этом изменения заряда цепей не происходит.

Диссоциированные полипептидные цепи разделяют затем методом изоэлектрического фокусирования, основанном на изменении заряда белковой молекулы при изменении рН окружающей среды. Каждый из белков может быть охарактеризован изоэлектрической точкой - значением рН, при котором суммарный заряд белковой молекулы равен нулю, и, следовательно, белок не способен перемещаться под действием электрического поля. При изоэлектрическом фокусировании белки подвергаются электрофорезу в геле, в котором с помощью специальных буферов создается градиент рН. Под действием электрического поля каждый белок перемещается в ту зону градиента, которая соответствует его изоэлектрической точке и остается в ней.

Так происходит разделение белков в одном направлении двумерного гель-электрофореза. На втором этапе гель, содержащий разделенные белки, снова подвергается электрофорезу, на этот раз в направлении перпендикулярном тому, что на первом этапе. В этом случае электрофорез ведут в присутствии ДСН и белки разделяют по их молекулярной массе, как в одномерном ДСН-ПААГ. Исходный гель пропитывают додецил-сульфатом натрия и, поместив его на блок ДСН-ПААГ-геля, проводят электрофорез, в ходе которого каждая из полипептидных цепей мигрирует сквозь блок геля и образует в нем отдельную полосу. Неразделенными в результате остаются только те бели, которые неразличимы как по изоэлектрической точке, так и по молекулярной массе; такое сочетание встречается очень редко.




Читайте:


Добавить комментарий


Защитный код
Обновить

Микроорганизмы и человек:

От младенчества до старости

Несмотря на то что видовой состав микроорганизмов кишечника достаточно однообразен, количественное соотношение предста...

Человек и микроорганизмы - за кем будущее?

Признавая роль Творца в построении мира, трудно себе представить, чтобы в такой работе ставилась задача создать среди ...

Невидимый орган - микрофлора человека

На рубеже ХХI века сформировалось представление о микрофлоре организма человека как о еще одном органе, покрывающим в ...

Иммунитет:

Выращивание вирусов

Приспособление Карреля позволяло поддерживать сердце ку­риного эмбриона в живом состоянии в течение 34 лет - время, ку...

Специфический и неспецифический иммунитет

Устойчивость организма к различным вирусам, инфекциям во многом зависит от иммунитета. Именно хорошая иммунная защита на...

Инструменты организма

Как работает вакцина? Какие изменения в организме проис­ходят после ее введения? Какова химическая природа иммунитета?...